按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发〔2010〕194号）（以下简称《管理办法》）附件《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》文件要求，笔者归纳以下几条供为参考 ：

1、目前市场上已获证PCR试剂以荧光定量检测试剂为主，测序方法的试剂仅有一种，考虑到测序实验室要求更复杂，不利于当前疫情下的快速建设，我们建议临床基因扩增检验实验室主要设置以下三个区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增与产物分析区。这三个区域在物理空间上必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通；

2、实验室以清洁区、半污染区和污染区的概念设置成公共走廊、各实验室与走廊之间的缓冲区及实验操作区。各区域顶部加装紫外灯，实验结束后需用紫外照射各个区域进行消毒处理；

3、实验室的空气流向可按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增与产物分析区进行，防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。可按照从试剂储存和准备区→标本制备区→扩增与产物分析区方向空气压力递减的方式进行。针对本次新型冠状病毒的高度传染性，我们建议PCR实验室除了要考虑保障样本不被污染，同时也要高度关注工作人员与环境的生物安全。因此，在有条件的实验室尽可能采用负压排风装置（带空气过滤）。

4、采用人流、物流分流方式。人员走专用缓冲间，可以在缓冲间内更换专用工作服；在标本制备区与公共走廊之间加设样本接收传递窗（带紫外消毒装置）；

5、设置专用污物通道及洗消间（可高温高压）。把实验过程中的废弃物当作高风险传染源对待，实验结束后的废弃物走专用污物通道进入洗消间，高温高压处理后出实验室，比如可以在实验室间加装传递窗装置（与传递样本的传递窗分开），将实验室废弃物从试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区→洗消间传递；

6、针对无法连续布局的实验室，重点关注标本制备区，建议单独设置负压排风装置（带空气过滤），不建议采用排风扇装置进行排风。考虑在标本制备区设置上下两个带紫外照射的传递窗，上层传递窗传送接收的标本，下层传递窗放置实验室废弃物，紫外照射30分钟后取出送医疗废物处理；

7、实验室缓冲间两侧加装水点，作为操作人员进出缓冲间前的洗手用途；

PCR实验室的标准设备配置包括：荧光定量PCR仪、生物安全柜、全自动核酸提取仪（可选，品牌型号根据选择的提取试剂而定，有封闭试剂和开放试剂两种）、高速冷冻离心机、磁力架（可选，手工磁珠提取法需配置）、微量移液器、恒温金属浴、旋涡混匀器、掌式离心机（可离心0.5ml离心管、1.5ml离心管、0.2ml八排管）、可移动紫外车、冰箱（2-8℃，-20℃或-80℃）等。

由于本次疫情中待检测样本多，为了提高工作效率，建议在PCR仪的选择上以实用为主，结合目前获证新型冠状病毒检测试剂盒最多用到四个检测通道，可以考虑选择96通量且价格适中的设备，比如ABI7300PLUS、ABI7500及国产宏石SLAN，根据当地疫情状况，准备1~2台PCR仪为宜；生物安全柜的选择上，建议为100%全排。

按照《管理办法》要求，PCR实验室操作人员需要取得临床检验中心颁发的《上岗证》才能开展病毒核酸检测工作。疫情状态下，是否可以应急远程培训操作人员上岗，建议相关管理部门进行评估与指导。

新型冠状病毒为RNA病毒，处理不当的情况下，易发生降解导致假阴性。近期媒体报道的几例假阴性病例可能与此有关联。根据经验，对操作人员在实验过程中的建议如下：

1、操作人员进入缓冲间，务必穿戴好实验区专用工作服（每个区域工作服颜色不同）+个人防护服；

2、在样本处理前，佩戴护目镜，开始实验前准备工作，用清水擦拭台面、准备实验耗材（如在核酸提取仪上摆放Tip头、PCR反应管、试剂瓶、废液收集瓶、废弃物收集袋等）、准备含有效氯0.55%的废液消毒液等；

3、针对采集的样本，先对病毒进行灭活处理，处理方式可以参考所选择试剂盒的操作步骤（建议选择病毒保存与灭活同步进行的试剂）；

4、操作过程中严格遵守试剂盒说明书要求，同时需要严格防止交叉污染的发生，当不确认手套或者Tip头是否有接触样本或者其他潜在污染物时，及时更换手套和Tip头；

5、实验过程中保持平静的心情，轻拿轻放；

6、实验结束后，立即对工作台面进行清洁，可用含有效氯0.55%的消毒液（消毒液现用现配）进行擦拭，同时对废弃溶液进行处理，处理方式参考《国家卫健委公布<新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）>》;

7、离开实验区前，脱下个人防护服，由里往外折叠，放入固体废弃物垃圾桶，将垃圾袋打包，放入污染物传递窗；

8、开启近台面60-90cm紫外灯照射，脱弃手套，洗手后进入缓冲区，更换工作服；

9、开启实验区顶部紫外灯，离开缓冲区；

10、开启缓冲区及污染物传递窗紫外消毒灯；

11、固体废弃物的处理方式参考《国家卫健委公布<新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）>》。

截止发稿时间，国家药品监督管理局应急审批通过7家核酸检测产品，目前尚有多家试剂公司正在提交应急审批，以应对疫情的需要。在试剂盒的选择上，笔者推荐实验室考虑以下因素：

1、核酸提取方法与操作流程：

已批准试剂盒的提取方案包括柱提取（推荐凯杰或者厂家自产试剂盒）、磁珠提取（厂家匹配试剂盒）及一步法，其中经过柱提取和磁珠提取方法得到的病毒核酸纯度更高，但是两种方法采用手工操作时，步骤复杂，操作时间过长，处理96个样本的时间约为3个小时以上，故部分试剂厂家有推荐核酸提取仪代替人工操作，处理96个样本的时间一般在96分钟至240分钟不等。

核酸提取仪从工作流程上模拟手工操作，加热孵育、振荡混匀、反应液配制及加样过程均在仪器内部完成，部分仪器还配备有HEPA过滤装置和紫外灯。仪器内部空间狭小，实验过程中由于加热、振荡、移液等动作，仍不可避免气溶胶的产生，会导致假阳性结果的产生，故使用核酸提取仪时，请重点关注仪器的定期维护和清洁，同时建议随机增加阴性质控和空白液质控的数量。

现在已批准和正在报批的一些试剂中开始采用创新性的一步法RNA提取与RT-PCR技术，减少或者免去了核酸提取的过程，大大减少了操作时间和人员暴露机会，同时可以缩短病人报告的发出时间，有利于当前疫情快速响应机制的要求。但是在正式使用前，建议实验室还是需要做出适当的试剂评价。

2、检测时间：

新型冠状病毒属于RNA病毒，在荧光检测之前，需要对提取好的RNA进行反转录操作，目前市场上的试剂盒均采用了RT-PCR方法，即反转录和PCR扩增过程在一管中完成，但是各家选择的反转录酶及反应条件的优化上存在一些差异，导致上机检测的时间从1小时到3小时不等。

3、内标质控：

选择有内标质控的试剂盒可以帮助实验室有效监控假阴性结果的发生。

内标在中国临床PCR室是个通俗叫法，专业名称是内部质控（Internal Control，简称IC）,主要作用机制是以固定量加入到样本中，随样本基因一同参与提取和扩增的过程，对全过程进行监控，结果判断可以参考如下：

· 当IC阳性时，样本结果无论阴阳性都可视为正确；

· 当IC阴性时，样本结果阴性可视为假阴性结果；

· 当IC阴性时，样本结果如果为强阳性，可视为结果正常；

· 当IC的ct值偏后时，样本结果如果为阴性或者ct值偏后，可以判断为过程受抑制，需要对该样本或者核酸进行稀释后重新检测。