【直播回顾】王海滨:如何选择合适的核酸检测试剂·浦江分子诊断大讲堂第三十七讲
目前,我国新冠肺炎疫情防控已向好态势进一步巩固,防控工作已从应急状态转为常态化。对于新冠肺炎的防控,快速、准确的检测是重要保障,核酸检测则是其不可或缺的手段之一。浦江分子大讲堂邀请了原中国人民解放军第302医院分子诊断室主任王海滨教授担任直播嘉宾,与大家分享新冠核酸检测与荧光PCR质量控制,解读如何选择合适的核酸检测试剂,获得更加精准的检验结果。

PCR方法应用于临床检测项目以来,历经多次技术更新换代,每代新技术的出现都不同程度解决了上一代存在的问题,随着临床需求的提高,又出现新的问题,譬如随着敏感性的提升和自动化系统的应用,污染便成了困扰实验室质量的顽疾。王教授认为,总结了十余家PCR实验室存在的问题,规范操作和技术革新是解决问题的重要手段。而荧光PCR作为我国临床检验少有的国际领先技术,应发挥其应有的价值。
王海滨教授首先介绍了核酸检测在传染病诊疗中的应用,关于新型冠状病毒核酸检测,王教授从实验室的安全性、样本类型的选择、样本是否需要灭活、实验室的设置、试剂盒的分类和性能等问题进行了详细阐述。样本的特征导致新冠病毒可以用“一步法”进行检测,试剂盒的配方需要具有多环节抗RNA酶的功能。创新的RT-PCR“一步法”,是一种集样本灭活、核酸裂解、RNA保存于一体,免核酸提取、免试剂配置的“一步法”解决方案。具有安全、快速高效、便捷、不易漏检等优势。在制备过程中不存在核酸丢失的问题,直接在PCR管中操作即可,减少了操作耗费的时间,快速、高效、便捷。从源头杜绝了分子诊断各环节中产生的再次感染医务工作者的问题,安全性高。
在关于新型冠状病毒核酸检测的假阴性问题上,王海滨教授认为可能存在以下几种原因:
不同病期采集样本检测敏感性的差异、样本采集质量、核酸提取的效率和核酸丢失量、试剂盒质量、多色荧光的相互干扰、样本灭活、操作人员因素等。
对于如何提升核酸检测质量的问题,王海滨教授认为:第一,要选择有多色荧光研发和生产经验的试剂厂家的优质试剂盒;第二,要选择有病毒灭活功能的样本保存液,减少再次病毒灭活的流程;第三,要进行娴熟而快速的操作,减少核酸降解和时间差导致的假阴性;第四,核酸纯化试剂需要彻底溶解,扩增试剂要即用即配;第五,实验室切勿多度消毒,有效率消毒液不但对病毒有杀灭作用,对探针荧光基团也具有淬灭作用;第六,操作人员要有丰富的分子生物学知识,了解操作关键点,有助提升核酸检测质量。
王海滨教授还为大家介绍了我国临床荧光PCR技术的进化:
01
第一代:酚氯提取+电泳检测
进化:由细胞水平进化到分子生物学水平
缺陷:复杂、定性、实验室污染
02
第二代:煮沸裂解+Q-PCR技术
进化:荧光定量、闭管核酸鉴定
缺陷:气溶胶污染、敏感性低
03
第三代:“微量核酸释放剂”法
进化:简单、免核酸提取
缺陷:敏感性低、操作要求高、实验室污染
04
第四代:“磁珠”动态核酸提取技术
进化:敏感性提升、自动化
缺陷:实验室污染、速度慢
05
第五代:“磁珠”静态核酸制备技术
进化:操作简单、可标准化、污染可控
缺陷:目前尚未实现完全自动化
PCR技术从最早的酚氯仿核酸纯化方法和开发性电泳核酸鉴定,到采用“静态核酸制备技术”和封闭荧光信号收集,经历了5次更新换代(Generation)。
1G至4G技术的共同特征是移液、移管、洗脱等动态操作导致核酸外露,实验室污染是最大的问题。只有废除缺陷步骤,才能真正解决实验室污染问题和实现准确检测。
5G静态核酸制备技术优点有:第一,污染可控,临床实验室污染可控甚至杜绝污染。第二,重复性好,检测样本加入核酸裂解液中无需混匀,无释放核酸外露,对操作人员技术要求低。超强磁珠吸附,废液无磁珠丢失,无核酸外露。静态漂洗、磁珠无需分散、无核酸移动。磁珠参与PCR扩增,无核酸洗脱步骤。第三,敏感性高,裂解液、漂洗液少量残留无影响,整个过程无核酸丢失,参与PCR扩增的构象磁珠无干扰抑制。第四,滚动报告,快速、低成本、效率高。
随着科学技术的不断发展,新一代技术解决了上一代存在的问题,同时又提出了新的挑战。结合PCR技术的发展现状,不断创新和完善PCR技术是亟待解决的重大课题。充分运用它,人类会在文明发展的进程中,发出更耀眼的光芒。
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